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Caracterização microbiológica por biologia molecular
As técnicas de biologia molecular
As técnicas de biologia molecular permitem detetar, identificar, tipificar e quantificar microrganismos com base nos seus ácidos nucleicos (ADN ou ARN), independentemente da sua capacidade de crescer em cultura. Isto é especialmente útil para microrganismos viáveis mas não cultiváveis, como norovírus e Candidatus Liberibacter sp., entre outros; matrizes inibidoras ou situações em que se procura elevada sensibilidade, especificidade e rapidez.
AINIA dispõe de experiência no desenvolvimento e otimização de diferentes técnicas de biologia molecular para assegurar a qualidade e segurança de produtos e instalações, razão pela qual inclui na sua carteira de serviços múltiplas técnicas de biologia molecular para a deteção rápida de patogénicos.
Aplicações
Existem diferentes tipos de técnicas de biologia molecular através das quais é possível detetar e quantificar de forma específica genes e fragmentos de ADN e ARN de microrganismos de interesse. Estes microrganismos podem ser relevantes pela sua capacidade patogénica, alterante ou pelos seus benefícios para a saúde, alimentação humana e animal, agricultura (biocontrolo e biofertilizantes), ambiente (biorremediação), e processos industriais e biotecnológicos, sendo nestes casos fundamental avaliar a sua autenticidade e concentração. Como técnicas disponíveis, destacam-se:
- PCR convencional permite a deteção qualitativa de um gene ou fragmento específico de ADN, sendo aplicada na confirmação de colónias, deteção de genes de virulência ou resistência, identificação básica.
- PCR em tempo real baseia-se na deteção e quantificação relativa de ADN (cópia do gene alvo), sendo aplicada no controlo microbiológico rápido de patogénicos e microrganismos alterantes em águas, alimentos, fertilizantes, material vegetal, suportes de amostragem de superfícies (zaragatoas, toalhetes, etc.), cosméticos e farma.
- RT-qPCR (Reverse Transcription PCR) permite a deteção e quantificação de ARN (viral, ribossómico ou mensageiro), sendo aplicada no controlo de vírus ARN (norovírus, Hepatite A), estudos de expressão génica e viabilidade microbiana.
- PCR Multiplex centra-se na deteção simultânea de vários genes ou microrganismos numa única reação, sendo aplicada em painéis de patogénicos, deteção de serótipos, genes de resistência ou virulência.
- PCR Digital (dPCR) permite a quantificação absoluta de ADN sem necessidade de curva padrão, sendo aplicada na deteção de patogénicos em baixa concentração, matrizes complexas, e no acompanhamento e autenticação de estirpes de interesse em diferentes produtos (formulações infantis, probióticos, fertilizantes, suplementos alimentares, culturas iniciadoras, etc.), avaliando a sua concentração em valor absoluto.
- PCR de Viáveis (vPCR — Viability PCR) permite distinguir microrganismos vivos de mortos através de PCR, utilizando agentes intercalantes de ADN, podendo detetar apenas células não cultivadas, facilitando a validação da eficácia de desinfetantes, controlo rápido de viabilidade, análise de VBNC (Viable But NonCulturable) em cosméticos, farma e alimentos.
- REP-PCR baseia-se na amplificação de regiões entre sequências repetitivas palindrómicas extragénicas (REP), gerando padrões genéticos para diferenciar estirpes, sendo aplicada na tipificação e diferenciação de estirpes bacterianas, estudos epidemiológicos, controlo de qualidade e rastreabilidade de estirpes em microbiologia alimentar, ambiental ou clínica, e comparação da diversidade genética dentro de uma espécie.
| Técnica | Principio | Objetivo | Ventajas | Aplicaciones en Microbiología |
|---|---|---|---|---|
| PCR Convencional | Amplificación de ADN mediante ciclos térmicos; detección final por electroforesis. | Detección cualitativa de genes específicos. | Simple, económica, muy específica. | Confirmación de colonias, detección de genes de virulencia o resistencia, identificación básica. |
| PCR en Tiempo Real (qPCR) | Amplificación y detección simultánea mediante fluorescencia (SYBR Green o sondas). | Detección y cuantificación de ADN. | Alta sensibilidad, rapidez, cuantificación absoluta/relativa. | Recuentos rápidos, control microbiológico en agua, alimentos, cosméticos y farma; P/A por Ct. |
| RT-PCR / RTqPCR | Conversión de ARN a ADNc (transcripción inversa) seguido de PCR o qPCR. | Detección o cuantificación de ARN. | Indica viabilidad/actividad metabólica; esencial para virus ARN. | Virus ARN (norovirus, SARS CoV-2), expresión génica, estudios de viabilidad. |
| PCR Multiplex | Amplificación simultánea de varios genes mediante múltiples cebadores. | Detectar varios microorganismos o genes a la vez. | Ahorro de tiempo y reactivos; análisis multigénico. | Paneles de patógenos, serotipado, genes de resistencia. |
| PCR Digital (dPCR) | Particionado de la muestra en miles de microreacciones y cuantificación absoluta. | Cuantificación absoluta sin curva estándar. | Extremada precisión; menos afectada por inhibidores; ideal para cargas bajas. | Matrices complejas, patógenos de baja concentración, estudios de mutaciones minoritarias. |
| PCR de Viables (vPCR) | Uso de colorantes intercalantes (PMA/EMA) que bloquean el ADN de células muertas. | Diferenciar viables vs. no viables. | Selectividad hacia células vivas sin cultivo; útil en matrices con conservantes. | Control rápido de viabilidad, validación de desinfectantes, estudio de células VBNC. |
| REP-PCR | Amplificación de regiones entre secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas (REP). | Generar patrones genéticos (fingerprints) para diferenciar cepas. | Rápida, económica, buena resolución para estudios de diversidad y trazabilidad. | Tipificación y diferenciación bacteriana, estudios epidemiológicos, control de calidad y trazabilidad de cepas, comparación de diversidad genética dentro de una misma especie. |
Vantagens competitivas da AINIA
- Serviços integrais de ensaios microbiológicos com aconselhamento técnico para selecionar a metodologia ótima por produto e finalidade (I&D, controlo de qualidade, otimização de processos).
- Disponibilidade de procedimentos de referência, normas ISO, acreditados pela ENAC e CRBG (Coleção de Recursos Biológicos e Genéticos), para validação e verificação de métodos alternativos baseados em técnicas de biologia molecular em alimentos, de acordo com a norma ISO 16140.
- Agilidade no desenho e otimização de métodos específicos baseados em técnicas de biologia molecular para deteção, quantificação e tipificação específica de microrganismos de interesse para a empresa.
- Ampla carteira de serviços acreditados pela ENAC para análise rápida de patogénicos alimentares (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli produtora de toxina shiga STEC, Yersinia enterocolitica patogénica, norovírus, Hepatite A, etc.) e fitopatogénicos (pragas prioritárias como Xylella fastidiosa, Candidatus Liberibacter sp., etc., de acordo com normas EPPO), entre outros.
- Integração em planos analíticos personalizados juntamente com outros serviços físico-químicos, oferecendo soluções flexíveis e adaptadas a cada cliente.
- Acordos analíticos com libertação positiva e atividade ao fim de semana.
- Designados como controlo oficial para ensaios baseados na aplicação de técnicas de biologia molecular (qPCR, RT-PCR, etc.)
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Consulta online da rastreabilidade das amostras, resultados em tempo real, comparações com especificações legais ou do cliente, descarga de relatórios e do histórico em Excel.
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Relatórios em inglês sem custo adicional, mediante solicitação.
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Equipa especializada para a recolha de amostras (superfícies, ambientes, estabelecimentos designados…).
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Serviços de alerta 24h para cobrir emergências no âmbito da segurança alimentar.
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(tel: 963 052 525 · mail: operaciones@ainia.es).
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Sonia Marco
Responsável do Laboratório de Microbiologia
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