- Laboratoire
Caractérisation microbiologique par biologie moléculaire
Les techniques de biologie moléculaire
Les techniques de biologie moléculaire permettent de détecter, identifier, typer et quantifier les microorganismes sur la base de leurs acides nucléiques (ADN ou ARN), indépendamment de leur capacité à se développer en culture. Cela est particulièrement utile pour les microorganismes viables mais non cultivables, tels que les norovirus et Candidatus Liberibacter sp., entre autres ; matrices inhibitrices ou situations où une haute sensibilité, spécificité et rapidité sont recherchées.
AINIA dispose d’une expérience dans le développement et l’optimisation de différentes techniques de biologie moléculaire afin d’assurer la qualité et la sécurité des produits et des installations, raison pour laquelle elle inclut dans son portefeuille de services de nombreuses techniques de biologie moléculaire pour la détection rapide des pathogènes.
Aplicaciones
Il existe différents types de techniques de biologie moléculaire permettant de détecter et de quantifier de manière spécifique des gènes et fragments d’ADN et d’ARN de microorganismes d’intérêt. Ces microorganismes peuvent être d’intérêt pour leur capacité pathogène, altérante ou pour leurs bénéfices pour la santé, l’alimentation humaine et animale, l’agriculture (biocontrôle et biofertilisants), l’environnement (bioremédiation), et les processus industriels et biotechnologiques, étant dans ces cas essentielle l’évaluation de leur authenticité et de leur concentration. Parmi les techniques disponibles, on peut citer :
- PCR conventionnelle permet la détection qualitative d’un gène ou fragment spécifique d’ADN, appliquée à la confirmation de colonies, la détection de gènes de virulence ou de résistance, et l’identification de base.
- PCR en temps réel repose sur la détection et la quantification relative de l’ADN (copie du gène cible), appliquée au contrôle microbiologique rapide des pathogènes et microorganismes altérants dans les eaux, aliments, fertilisants, matériel végétal, supports d’échantillonnage de surfaces (écouvillons, lingettes, etc.), cosmétiques et pharma.
- RT-qPCR (Reverse Transcription PCR) permet la détection et la quantification de l’ARN (viral, ribosomal ou messager), appliquée au contrôle des virus à ARN (norovirus, Hépatite A), aux études d’expression génique et à la viabilité microbienne.
- PCR Multiplex se concentre sur la détection simultanée de plusieurs gènes ou microorganismes dans une seule réaction, appliquée aux panels de pathogènes, à la détection de sérotypes, de gènes de résistance ou de virulence.
- PCR Digitale (dPCR) permet la quantification absolue de l’ADN sans nécessiter de courbe étalon, appliquée à la détection de pathogènes à faible concentration, dans des matrices complexes, et au suivi et à l’authenticité de souches d’intérêt dans différents produits (formulations infantiles, probiotiques, fertilisants, compléments alimentaires, cultures de départ, etc.), en évaluant leur concentration en valeur absolue.
- PCR de Viables (vPCR — Viability PCR) permet de distinguer les microorganismes vivants des morts par PCR, en utilisant des agents intercalants de l’ADN, pouvant détecter uniquement des cellules non cultivées, facilitant la validation de l’efficacité des désinfectants, le contrôle rapide de la viabilité, l’analyse des VBNC (Viable But NonCulturable) en cosmétique, pharma et alimentaire.
- REP-PCR se base sur l’amplification de régions entre des séquences répétitives palindromiques extragéniques (REP), générant des profils génétiques pour différencier les souches, appliquée à la typage et différenciation de souches bactériennes, aux études épidémiologiques, au contrôle qualité et à la traçabilité des souches en microbiologie alimentaire, environnementale ou clinique, et à la comparaison de la diversité génétique au sein d’une espèce.
| Técnica | Principio | Objetivo | Ventajas | Aplicaciones en Microbiología |
|---|---|---|---|---|
| PCR Convencional | Amplificación de ADN mediante ciclos térmicos; detección final por electroforesis. | Detección cualitativa de genes específicos. | Simple, económica, muy específica. | Confirmación de colonias, detección de genes de virulencia o resistencia, identificación básica. |
| PCR en Tiempo Real (qPCR) | Amplificación y detección simultánea mediante fluorescencia (SYBR Green o sondas). | Detección y cuantificación de ADN. | Alta sensibilidad, rapidez, cuantificación absoluta/relativa. | Recuentos rápidos, control microbiológico en agua, alimentos, cosméticos y farma; P/A por Ct. |
| RT-PCR / RTqPCR | Conversión de ARN a ADNc (transcripción inversa) seguido de PCR o qPCR. | Detección o cuantificación de ARN. | Indica viabilidad/actividad metabólica; esencial para virus ARN. | Virus ARN (norovirus, SARS CoV-2), expresión génica, estudios de viabilidad. |
| PCR Multiplex | Amplificación simultánea de varios genes mediante múltiples cebadores. | Detectar varios microorganismos o genes a la vez. | Ahorro de tiempo y reactivos; análisis multigénico. | Paneles de patógenos, serotipado, genes de resistencia. |
| PCR Digital (dPCR) | Particionado de la muestra en miles de microreacciones y cuantificación absoluta. | Cuantificación absoluta sin curva estándar. | Extremada precisión; menos afectada por inhibidores; ideal para cargas bajas. | Matrices complejas, patógenos de baja concentración, estudios de mutaciones minoritarias. |
| PCR de Viables (vPCR) | Uso de colorantes intercalantes (PMA/EMA) que bloquean el ADN de células muertas. | Diferenciar viables vs. no viables. | Selectividad hacia células vivas sin cultivo; útil en matrices con conservantes. | Control rápido de viabilidad, validación de desinfectantes, estudio de células VBNC. |
| REP-PCR | Amplificación de regiones entre secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas (REP). | Generar patrones genéticos (fingerprints) para diferenciar cepas. | Rápida, económica, buena resolución para estudios de diversidad y trazabilidad. | Tipificación y diferenciación bacteriana, estudios epidemiológicos, control de calidad y trazabilidad de cepas, comparación de diversidad genética dentro de una misma especie. |
Avantages concurrentiels d’AINIA
- Services intégrés d’essais microbiologiques avec conseil technique pour sélectionner la méthodologie optimale selon le produit et la finalité (R&D, contrôle qualité, optimisation des processus).
- Disponibilité de procédures de référence, normes ISO, accréditées par ENAC et CRBG (Collection de Ressources Biologiques et Génétiques), pour la validation et vérification de méthodes alternatives basées sur des techniques de biologie moléculaire dans les aliments, conformément à la norme ISO 16140.
- Agilité dans la conception et l’optimisation de méthodes spécifiques basées sur des techniques de biologie moléculaire pour la détection, quantification et typage spécifique de microorganismes d’intérêt pour l’entreprise.
- Large portefeuille de services accrédités par ENAC pour l’analyse rapide de pathogènes alimentaires (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, E. coli producteur de toxine shiga STEC, Yersinia enterocolitica pathogène, norovirus, Hépatite A, etc.) et phytopathogènes (organismes nuisibles prioritaires tels que Xylella fastidiosa, Candidatus Liberibacter sp., etc., conformément aux normes EPPO), entre autres.
- Intégration dans des plans analytiques personnalisés avec d’autres services physico-chimiques, apportant des solutions flexibles et adaptées à chaque client.
- Accords analytiques avec libération positive et activité le week-end.
- Désignés comme contrôle officiel pour des essais basés sur l’application de techniques de biologie moléculaire (qPCR, RT-PCR, etc.)
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Consultation en ligne de la traçabilité des échantillons, résultats en temps réel, comparaisons avec les spécifications légales ou client, téléchargement de rapports et de l’historique en Excel.
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Équipe spécialisée pour la prise et la collecte d’échantillons (surfaces, environnements, établissements désignés…).
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Services d’alerte 24h pour couvrir les urgences dans le domaine de la sécurité alimentaire.
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Secteurs d’application
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Chimique
Cosmétique
Environnement
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Agricole
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Sonia Marco
Responsable du laboratoire de microbiologie
